論文研究（二）| 緩沖體系可能對LNP的性質與穩定性有較大影響
更新時間：2023-08-29 點擊次數：1523次
我們接著這個話題，通過一篇美國俄勒岡州立大學藥學院的研究論文，進一步討論緩沖體系對mRNA-LNP的影響，供大家參考。
該研究測試了三種常見生物緩沖液——HEPES、Tris和PBS——在單次凍融前后與DLin-MC3-DMA mRNA-LNP制劑的相容性。通過電子顯微鏡、差示掃描量熱法和膜流動性分析發現，不同緩沖液使LNP形態發生了不同的結構變化。采用體外和體內模型測量mRNA轉染效率，發現Tris或HEPES緩沖液中的LNPs具有更好的冷凍保護效果以及與PBS相比更高的轉染效率。
該研究中LNP配方及表征方法
將螢火蟲熒光素酶(FLuc) mRNA用50 mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 4)和分子級水稀釋，達到所需體積。將DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇和DMG-PEG-2000溶解在總脂質濃度為5.5 mM的純乙醇(摩爾比為50:10:38:1.5)中，以3:1的體積比(水/乙醇)和9 mL/min的總流速通過標準微流控混合制備LNPs。
制備用于透析的HEPES、Tris和PBS（詳見下圖a，Tris即為Tris Buffer，HBS即為HEPES Buffer），其鹽度為150 mM, pH為7.4。配制后，立即將LNPs轉移到10個kDa MWCO盒中，并在各自的緩沖液中以1000倍的體積透析4小時和過夜。透析后，LNPs在Amicon Ultra離心過濾裝置中以3000g離心濃縮，分子量截止為100 kDa(Millipore Sigma, Burlington, MA)。
使用Zetasizer Nano ZSP對LNPs進行了水動力尺寸、多分散性指數和表面zeta電位的表征。對于Zetasizer分析，LNPs在各自的緩沖液中稀釋，得到三次測量結果。為了量化mRNA的包封效率和濃度，采用了改進的Quanti-iT RiboGreen RNA(Invitrogen)方案。
研究成果
1 緩沖液對LNP的形成和短期穩定性的影響可以忽略不計
通過標準的微流體混合程序制備含有FLuc mRNA的LNP。DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇和DMG-PEG-2000脂質按50:10:38.5:1.5摩爾比混合，pH 4檸檬酸緩沖液中的mRNA溶液與乙醇脂質混合物的體積比為3:1，總流速為9 mL/min。然后將所得的LNP懸浮液分成三等份，分別與PBS、Tris或HEPES進行透析。
透析后，將LNPs濃縮，并通過動態光散射(DLS)和改進的核糖綠測定法進行分析。
DLS分析顯示，三種緩沖液中LNPs顆粒大小幾乎相同，約為70 nm，PDI約為0.05。
位值表明，PBS和Tris配方的表面電荷略為負(約?3mV)，HEPES配方的表面電荷為中性，三種緩沖液中包封率均為>92%。
LNP的冷凍透射電鏡顯微照片也沒有顯示任何顯著的形態變化，這表明緩沖液對LNP的形成、形態或短期穩定性的影響可以忽略不計。
3.2 低溫凍存復溶后，不同緩沖液中LNP關鍵表征出現差異
在- 20℃下保存三周后，將不同緩沖溶液中的LNPs在室溫下解凍30分鐘，立即用于研究。
①粒徑
儲存在HEPES和PBS中的樣品在FT后的平均粒徑增大了約50%，而儲存在Tris中的LNPs的粒徑減小了約10 nm。
②PDI
HEPES和Tris中LNPs的PDI在凍融前后基本保持一致，而PBS中LNPs在解凍后PDI增加了3倍（上圖b）。FT后Zeta電位也略有下降（上圖d）。
③LNP形態
LNP形態受到凍融的嚴重影響，冷凍透射電鏡證實PBS緩沖液中的 LNP在大小上最多樣化，并且顯示出高度異質性的內部組織，以及顆粒聚集。這可能是脂質相和水相分離所導致。具體而言，PBS中的LNP包含典型的100 nm以下的致密LNPs，100~150nm的空脂質體樣結構，以及不同粒徑包載水相的LNPs，其中部分水相中含有mRNA。
DLS分析顯示，Tris中的LNPs盡管觀察到形態變化，但尺寸和PDI沒有明顯變化，這表明相比于PBS，Tris可能可以更大程度地抑制LNPs顆粒的聚集。
與新鮮LNPs相比，HEPES中的LNPs在凍融后出現du特的沙漏狀結構，尺寸略大(見下圖e)。在LNPs周圍形成的水泡似乎缺乏mRNA，這可能表明HEPES可以影響mRNA周圍脂質的堆積，例如，HEPES可以促進脂質與mRNA之間更強的靜電相互作用——HEPES LNPs的zeta電位是真正的中性的，而PBS和Tris LNPs具有?2至?5 mV的輕微負電荷，這可能表明當HEPES存在時，mRNA電荷的中和作用更有效。
此外，基于冷凍顯微圖像研究了脂質膜厚度的變化。
平均而言，脂膜厚度在FT后增加了15%，表明膜水合作用增加。
更具體地說，冷凍后，Tris LNPs的脂膜厚度增加了約0.8 nm, PBS增加了約0.6 nm, HEPES LNPs增加了約0.2 nm。尚不wan全清楚這些改變是否表明脂質膜成分發生變化或僅僅是水摻入的結果，但這些結果突出了解凍后LNPs的脂質膜發生了顯著變化，且不同緩沖體系中變化程度不同。
以上實驗結果表明，不同緩沖液對mRNA-LNPs的關鍵表征（形態、粒徑、PDI，脂質膜厚度等）可以產生較大影響。
3.3 轉染能力與內涵體逃逸的體外評估
①緩沖液影響LNP轉染能力
該研究評估了不同緩沖液中的LNPs的轉染能力和內涵體逃逸的程度。分別用包封FLuc mRNA的LNPs處理hela和HEK293T/17(后者用Gal9-GFP報告系統修飾)兩個細胞系，并在24小時后檢測。無論使用何種緩沖液，細胞存活率均保持在80%(下圖a,c)。轉染評價表明，緩沖液的轉染效率隨細胞系的不同而變化。在HeLa細胞中，LNPs轉染趨勢為HEPES＞PBS>Tris(下圖b)，而HEK293T/17細胞表現出Tris>HEPES>PBS的偏好(下圖d)。
一般來說，所有的mRNA-LNP制劑在解凍后轉染效果都有所下降。在HeLa細胞中，PBS LNPs的轉染效率下降最為嚴重，在所有處理中平均下降4倍，而HEPES在所有處理中平均下降2倍(下圖b)。對于HEK293T/17細胞系, HEPES和PBS LNPs均無統計學意義的下降，而Tris在100和200 ng時的LNPs分別下降了2 ~ 2.5倍(下圖d)。
②緩沖液影響內涵體逃逸效率
凝集素是一個與病原體入侵和免疫感知相關的糖結合凝集素家族。半乳糖凝集素如gal3、gal8和gal9從彌漫的細胞質表達重新分布到暴露的糖苷位點，這是由于內體內小葉暴露事件造成的，表明內涵體破壞。Gal9已被證明在報告細胞內涵體逃逸的檢測中具有最高的信噪比。因此，可利用Galectin 9 (Gal9)- gfp 修飾的HEK293T/17細胞系，評估FLuc mRNA LNPs的內涵體逃逸情況。
低劑量處理(50 ng)在所有新鮮LNPs中幾乎沒有變化，HEPES LNPs在FT后表現出最高的Gal9募集和zui顯著的變化(2.6倍)。
高劑量(200ng)處理組中，冷凍前Tris LNPs誘導了最高的Gal9募集。不同緩沖體系中的LNP對FT的反應wan全不同。PBS LNP減少了Gal9的招募，Tris LNPs幾乎沒有變化，HEPES LNPs增加了Gal9的招募。解凍后的HEPES LNPs內涵體逃逸的增加可能是低溫透射電鏡觀察到的形態學變化的結果。LNP形態的變化導致體外轉染的增加，因此HEPES可能促進了解凍后LNP形態的有利變化。
這些體外實驗數據進一步支持了LNP緩沖液組成對凍融后轉染效率的重要性，并揭示了細胞攝取的差異受到這些變化的影響。
3.4 體內成像評估mRNA表達情況
通過活體成像，探索了不同緩沖體系mRNA-LNP在體內的表達情況。將HEPES、Tris和PBS LNPs靜脈注射到年齡匹配的雌性BALB/c小鼠中，比較熒光素酶的表達水平和器官特異性。在注射后4和24 h時間點測量新鮮和解凍的LNPs的生物發光信號。
在所有案例中，生物發光圖像顯示強烈的肝臟轉染模式，與通常的LNP靜脈注射制劑一致。
總體而言，HEK293T/17細胞系的體內轉染趨勢與體外觀察到的相似(Tris > HEPES > PBS)。新鮮LNPs之間的交叉比較得出結論，與其他緩沖液相比，Tris組在給藥后4小時增加了2倍。這種功效的增強可能是由于脂質膜上的水置換改善了apoe介導的攝取，正如脂質膜厚度減少所表明的那樣。
然而，緩沖液導致了不同程度的轉染損失。對于給藥后4小時的FT組，HEPES顯示總通量減少約2倍，Tris顯示減少約3倍，PBS (LNP配方中最常見的緩沖液)導致總通量減少近9倍。
有趣的是，在24小時時間點，不同緩沖液樣品之間mRNA表達水平沒有統計學上的顯著差異。這可能是LNPs在血液中不斷循環，緩沖液作用減弱的結果。
總的來說，與先前的觀察結果一致，mRNA的傳遞受到凍融過程的影響。緩沖液對體內給藥效果的巨大影響表明，在LNP制備中選擇適宜的生物緩沖液，或可為保持mRNA-LNP的理化性質及生物學活性提供顯著優勢。
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